王锐l译文：怎样快速准确的采集口腔液？

这是一个系列的文章，前一篇介绍了“口腔液是什么？”，详见往期回顾。本文从绳子的选择、如何采集口腔液、样品保存、口腔液的前处理等多个方面进行了阐述，全文1200余字，大约需要3分钟时间阅读。

绳子选择

与尼龙绳、大麻绳或聚酯绳相比，棉绳在抗体和核酸检测方面提供了最好的整体诊断工具。对40kg以上的动物，收集口腔液的最佳选择是直径约1.6cm的三股棉绳，而较小动物更喜欢直径较小（＜4mm）的棉绳。

（PS：棉绳需要采用经过充分灭菌的采样棉绳套装，若在猪场内进行棉绳制备，可能会因为环境污染，导致猪群的交叉污染。博维特投资企业维特康检测技术公司向行业提供经过无菌处理过的采样套装，安全、简单，还配备灭活型核酸保护液体。）

如何采集口腔液

猪具有很强的好奇心，会乐意探索新鲜的东西，比如撕咬悬挂在围栏里的绳子，这使口腔液的采集变的具有操作性。当猪群中有一头或几头首先开始撕咬绳子后，其他猪只也会模仿。将棉绳悬吊30分钟，就可以很容易收集到足够的口腔液样本。根据测算，在大约25头猪的猪栏中悬挂绳子，在30分钟后可以采集到能代表80%猪只的口腔液样本。

根据观察，在早晨和喂食之前是采集口腔液的最佳时间。还有一个技巧：首次采样时，适当延长绳子悬挂时间（40-60分钟），可以训练猪只，在之后的采样操作中，更迅速地撕咬绳子，确保在30分钟内更好的收集到口腔液。

回收口腔液时，做好个人防护，取下绳子，将绳子湿的部分放入塑料袋中，用力挤压回收口腔液，最后把上清液转移到收集管。

同理，也可以用上述方法收集单头猪只的口腔液。

样品保存

关于抗体在猪口腔液中的稳定性研究的数据很少。从查阅到的有关PRRSV抗体在口腔液中降解相关的研究报道，了解到抗体在口腔液中的降解与温度相关，例如，在4℃保存的口腔液样品中，PRRSV 的ELISA结果显示，口腔液抗体可以稳定12-14天，温度越高降解速度越快。比如，在30℃条件下，72h后已无法在口腔液中检测到抗体。

冻融对口腔液的降解作用不大，在反复冻融循环的样品中，PRRSV的ELISA结果显示， S/P值未发生明显变化。

与上述情况相似，关于完整病毒或病毒核酸在口腔液中降解的信息很少。基于已发表的数据估计，应用RT-PCR技术检测到的口腔液中PRRSV-RNA的半衰期约13h（30℃）、42h（20℃）和14天以上（低于10℃）。温度越低，PRRSV-RNA半衰期越长。

与抗体不同的是，核酸易受冻融降解的影响。在4℃下过夜解冻口腔液比在22℃下解冻，PRRSV 核酸检测阳性率更高。

因此在现场采集口腔液时，为了保护抗体或核酸，在采集后应该尽快冷冻样本，通过冷藏（4℃）或将样品放入装有冰袋的泡沫箱中。

近年来，核酸保护液的研发和应用，可以在口腔液核酸的保存和运输中，起到较好的保护作用。

口腔液的前处理

在比较理想的情况下，收集的口腔液应是半透明的，杂质较少。然而，在实际应用过程中，口腔液常常含有不同程度的杂质，如粪便和饲料等残渣（如图1中A-E，显示不同杂质污染情况的口腔液）。

如何减少杂质污染，是口腔液采集过程中要十分注意的问题。例如，把绳子适当提高到猪只肩部的高度，可以一定程度上减少口腔液的污染。

实际上，在实验室检测中，上述杂质对口腔液的检测（核酸或抗体检测）影响并不大，但检测员反映，干净的样品检测操作更加方便。对于杂质过多的样品，可以通过低速离心，取上清液进行后续试验。

图1 猪口腔液样品的外观变化。a）实验条件下采集的口腔液；b）从限位栏饲养的个体猪只中采集的口腔液；c~e）从大栏饲养的猪群中采集的口腔液。

全群检测结果的阳性率

众所周知，随着猪群中感染并排毒的猪只比例的增加，阳性检出率（PCR或ELISA）也相应增加。

Olsen等人给实验猪接种PRRSV弱毒活疫苗，在14天后收集口腔液和血清，检测抗原和抗体检测。通过对口腔液检测结果（RNA或抗体）与猪群流行率之间的关系，建立数学回归模型进行分析（如表1所示），得到结论：每25头猪采集一份口腔液样品，可以最大程度上保证检测的阳性率与血清检测结果相符。

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