某养殖场保育病死猪样品致病菌的分离鉴定及药敏试验

背景和目的

我国西南某一点式饲养场，产房仔猪一周龄左右出现关节肿大等症状，发病率在5%-8%。发病猪表现关节肿大，前肢或后肢跛行，少部分猪只出现倒地不起。断奶后保育舍主要以关节炎、脑膜炎和败血症状为主，各症状发病率分别为5%、1%和1%。关节炎病猪主要症状是后肢关节肿大，前肢肿大比较少见。脑膜炎病猪主要表现为倒地不起以及神经症状。研究拟对病死猪样品进行病原学检测，重点筛查猪链球菌、副猪格拉瑟菌（原名副猪嗜血杆菌）等疑似病原菌。针对分离获得的菌株，进一步进行血清型分型鉴定以及测定其对15种临床常用抗菌药物的敏感性特征，为临床用药提供科学性参考意见。

材料和方法

2025年3月19日采集保育舍典型发病的3头病死猪样品，共计39份（脑、淋巴结、扁桃体、心脏、肝、脾、肺、肾、鼻拭子、关节液、胸腔液、血液、心包液各3份）。实验室人员取各病料器官样品，用酒精棉球点燃消毒病料表面，以脏器表面水分烘干为准，或直接用酒精灯火焰灼烧片刻，无菌手术刀切口后，用接种环蘸取样品切口内部（或将切口置于平板上涂抹，约1/5区域），划线于相应平板；拭子或组织液样品直接接种环蘸取后，划线于相应平板。平板做好标记后，倒置于37℃培养恒温中，18~24 h后观察菌落形态、大小、颜色等。挑取平板中的疑似单菌落，继续划线，直至平板中菌落形态一致。以纯化菌落或细菌悬液作为PCR模板，使用特异性引物（表1）对猪链球菌和副猪格拉瑟菌等呼吸道病原菌进行物种鉴定。针对疑似阳性菌落，进一步采用血清型特异性引物进行分型鉴定。参考（美国）临床和实验室标准协会指南（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法，对分离的疑似致病细菌开展针对15种常用抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）的测定。

表1 本实验所用引物

结果

对各样品初步分离时，各平板会出现形态各异的菌落，对疑似菌落采用特异性引物进行PCR检测。最终，在1号猪的腹腔积液、2号猪的鼻拭子和扁桃体、3号猪的肺、脾和扁桃体中共分离出6株猪链球菌，和其他细菌菌落相比，猪链球菌菌落相对较小，呈灰白色针尖状（图1）；在1号和3号猪的肺样品中分离出2株大肠杆菌；未分离出其他病菌。

图1 纯化的猪链球菌

对疑似致病的6株猪链球菌进行血清型分型鉴定（表2，图2），3株菌株的血清型为21、9、28型，其余3株未能确定，推测为非典型cps血清型。

表2 猪链球菌血清型鉴定结果

图2 猪链球菌血清型PCR扩增鉴定电泳图

采用微量肉汤稀释法测定了6株猪链球菌对15种抗菌药物的敏感性（表3）。结果显示菌株间存在耐药表型差异。分离菌株对头孢噻呋、阿莫西林和马波沙星较为敏感性，对青霉素、恩诺沙星和氟苯尼考的敏感性次之，所有菌株均对大环内酯类（红霉素、泰乐菌素）、林可胺类（林可霉素）、四环素类（四环素和多西环素）和泰妙菌素呈多重耐药表型，本场在临床治疗中应避免这些使用耐药谱系覆盖的抗菌药物。

表3 猪链球菌对15种抗菌药的敏感情况

结论和讨论

猪链球菌广泛分布于自然环境中，猪群普遍带菌，不同血清型的致病性不一样，出生仔猪早期就在上呼吸道有细菌定植，一般不引起发病，除非猪群存在应激或PRRSV感染等问题。猪链球菌的发病时间集中在产房阶段和断奶后的保育时期，临床表现以脑膜炎、关节炎为主，败血和心膜炎相对少些，中大猪偶有发生。伤口感染是产房仔猪链球菌的风险点，剪牙、阉割、断尾、打耳缺等人工操作时候，需要做好卫生和消毒工作，注射敏感抗生素作为预防性治疗措施。猪链球菌血清型众多，基于荚膜多糖抗原的差异，可分为29个传统血清型（11−19、21、23−25、27−31、1/2）。此外，基于荚膜基因簇的差异，近年来发现了Chz血清型和33种新荚膜基因簇菌株（NCL1−21a，21b−32）。商业化疫苗往往对不同血清型交叉性保护力较弱，有些欧洲猪场尝试用本场定制的自家苗免疫母猪，可为仔猪提供较好的母源保护，值得关注。

猪链球菌的耐药性呈日趋严重趋势，已经发现的四环素类耐药基因有核糖体保护蛋白基因tet（M）、tet（O）、tet（W）和tet（S）等；对酰胺醇类抗菌药物耐药机制主要有fexA、fexB、floR、cfr和optrA等基因；对大环内酯类耐药基因主要包括甲基化酶基因ermB和外排泵基因mefA等。猪链球菌还通过可移动遗传元件（MGEs）如原噬菌体、整合子、转座子、质粒和整合性接合元件（ICEs）等获得耐药性。这些元件可在不同细菌间转移，导致耐药性扩散。临床中有必要对发病猪群进行致病血清型的鉴定和药敏试验的测定，指导抗菌药物的选择和使用。

本次发病猪场采集典型的保育病死猪样品，除了链球菌和大肠杆菌，没有检测分离到副猪格拉瑟菌和巴氏杆菌等，这可能与临床治疗用药有关。针对分离到的可能致病的猪链球菌，药敏实验结果显示大环内酯类、林可胺类、四环素类和泰妙菌素呈现耐药，临床要减少使用或不使用，避免浪费。对分离菌株敏感的部分β-内酰胺类药物（主要是阿莫西林和头孢噻呋）和氟喹诺酮类药物（主要是马波沙星）可参照欧洲药品管理局的抗生素分类，将属于耐药性风险较高“B类”抗菌药物的头孢噻呋和马波沙星用于保育猪的治疗使用，将耐药性风险低的“D类”抗菌药物—阿莫西林用作产房猪群保健使用。

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