猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）属于冠状病毒科（Coronaviridae），α冠状病毒属的单股正链RNA病毒，主要引发猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）。PED是一种以仔猪急性腹泻、脱水、呕吐和高死亡率为主要症状的肠道传染病，自2010年在我国暴发以来，给养猪业造成了重大经济损失，严重影响我国养猪业的健康发展。笔者围绕PEDV的检测方法研究情况展开综述，旨在为防控PED提供一定的理论支持。

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PEDV病原学及流行病学

PEDV属冠状病毒科α冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形、有囊膜，直径95～190nm，基因组约28kb，含5'端帽子结构与3'端尾。其基因组有7个以上开放阅读框，可编码16种非结构蛋白及4种结构蛋白（S、E、N、M蛋白）。这些蛋白在感染中作用各异，其中N蛋白保守性强，能与病毒RNA结合形成核糖核蛋白复合物，参与转录与复制；S蛋白可与细胞膜受体结合，是病毒入侵细胞的关键蛋白，对毒力影响显著。PEDV于1971年在英国首次被报道，1982年相关疾病被命名为PED。我国1984年首次检出该病毒，但2010年大规模暴发后才受到广泛关注。目前，PEDV主要分为GⅠ和GⅡ两种基因型，并细分为5种亚型。GⅠ型为经典毒株，GⅡ型毒性较弱，是亚洲主要流行毒株。PEDV通过粪口、母乳和呼吸道传播，可感染各品种、各年龄段猪，引发急性腹泻、脱水、呕吐等症状，哺乳仔猪发病率和死亡率尤高。

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PEDV检测方法

2.1 病毒分离培养鉴定

该方法通常被视为病毒诊断的“黄金标准”，也是畜禽病毒性传染病常用的检测方法之一。在检测时，首先需要对选取的PEDV样本进行离心处理，然后取上层清液通过直径为0.22μm的微孔滤膜进行过滤。接着，将滤液接种于Vero细胞上进行传代培养，并通过观察是否出现细胞病变效应（CPE）来判断病毒的存在。若需进一步确定病毒种类，还需结合其他检测方法。然而，该方法操作复杂且周期长，不适用于快速诊断。

2.2 血清学检测

2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，利用相应的抗体抗原与之作用，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，充分反应后，通过洗涤法去除液相中的游离成分，最后借助显色剂来检测抗原或抗体的含量。常用的ELISA法有间接法和双抗体夹心法。在临床诊断方面，ELISA具有诊断速度快，操作简便，受环境条件限制较小等的特点，为临床监测PEDV感染情况和接种疫苗后的免疫保护状态提供了有效依据。但该方法在检测大批量样品时存在较大误差，易出现假阳性现象。随着技术进步，众多学者建立了针对不同抗体的ELISA检测方法。王婉莹等建立了用于检测PEDV IgA抗体的ELISA方法，不仅可以检测血清中IgA，还能检测分泌液中的IgA，扩大了检测样本范围；李桂珍等建立的抗PEDV IgY竞争ELISA方法，则具有良好的重复性和可靠性。

2.2.2 中和试验（SNT）

将收集的血清样本在56℃下加热灭活30min，然后倍比稀释，将稀释后的样本与等体积的200 TCID₅₀的PEDV混合，37℃环境下孵育1h，随后接种到Vero细胞，并检查CPE。中和抗体滴度以能够保护50%的细胞免受CPE影响的最高血清稀释度来表示。

2.3 免疫学检测

2.3.1 免疫荧光检测

取病猪小肠部位的样本，制作成小肠冰冻切片或黏膜抹片，用丙酮固定，然后采用荧光标记的抗体特异性识别病毒蛋白，对感染组织进行染色，之后在荧光显微镜下观察。若观察到细胞存在染色现象，便可确诊疾病。该方法操作复杂，对检测设备的依赖度较高。

2.3.2 免疫组化检测

该方法同样需要取病猪小肠部位的样本，将其制作成石蜡切片，然后用指示剂（如辣根过氧化物酶HRP）对抗体进行标记，通过化学反应使指示剂显色，再在显微镜下观察，以此确定组织细胞内的抗原。该方法主要用于检测猪肠道组织中的抗原，同样存在操作复杂、设备依赖度高的问题。

2.4 分子生物学检测

2.4.1 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

RT-PCR是通过设计特定引物、利用逆转录酶和DNA聚合酶，在体外将RNA逆转录成cDNA，并借助引物大量扩增目的基因，最后采用电泳技术检测目的条带结果的一种方法。相较于传统的检测方法，该方法针对病毒基因组进行检测，具有更高的特异性和灵敏度，被视为实验室检测该病毒的首选方法。然而，酶的选择、引物的设计以及其他实验条件都会对检测准确度产生影响，因此RT-PCR多用于临床样本的精确实验室检测。

2.4.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）

qRT-PCR在RT-PCR技术的基础上，通过在反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质在扩增过程中与DNA结合并释放荧光信号。通过监测扩增循环数，即可快速判断样本中的病毒含量。该方法灵敏度更高，在病毒检测领域得到了广泛应用，尤其是在新冠疫情流行期间病毒筛查工作中发挥了重要作用。近年来，不少研究发现，对常规探针进行修饰可进一步提高检测的灵敏度和特异性。例如，李艳等基于此设计了LNA（锁核酸）-TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，利用LNA对DNA、RNA的良好识别能力和强大亲和力来修饰常规探针，从而提高了检测结果的特异性和灵敏性。曹洪志等则将PEDV荧光定量PCR与微芯片技术相结合，建立了PEDV微芯片qRT-PCR检测方法。该方法不仅灵敏度高、特异性强、重复性好，而且大大缩短了检测时间。qRT-PCR技术结合了荧光定量技术和实时监测技术，实现了对病毒的定性和定量精准检测。此外，该技术还可直接观察扩增结果，无需进行电泳检测产物，从而降低了假阳性出现的概率。

2.4.3 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP是一种新型的核酸扩增方法，它利用链置换型DNA聚合酶在恒温（60～65℃）条件下进行反应，能够在1h内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增。反应结果可通过肉眼观察是否产生焦磷酸镁白色沉淀来判断靶基因的存在情况。李林岳等在LAMP的基础上进行了改进，在反应体系中加入甲酚红指示剂，建立了可视化RT-LAMP技术，可通过颜色变化来检测阳性结果。LAMP检测目标序列的灵敏度是PCR的10倍，能够在等温条件下以高特异性、高效率的方式大量扩增靶序列。

2.4.4 重组酶辅助扩增技术（RAA）

RAA技术是一种恒温快速扩增核酸的方法。在37～42℃的等温环境中，该技术可在短时间内对模板进行指数级扩增。RAA技术的重组酶来源广泛，对核酸模板的要求相对较低。与其他核酸检测技术相比，RAA技术具有耗时短、操作简便、设备依赖性弱等优势，更适用于基层的现场快速检测。然而，常规RAA技术的结果判读相对复杂，目前已有不少研究对此进行改进。例如，刘华等将RAA与规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）相关的Cas13a蛋白相结合，建立了RAA-Cas13a检测方法。该方法与传统方法相比，灵敏度更高，且与其他6种猪源病原核酸没有交叉反应，特异性较强。

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结论

PED被我国列为二类动物疫病，是影响我国养猪业发展的重大疾病之一。目前，PEDV呈高发状态，其遗传演化愈发复杂。不同PEDV毒株之间常发生重组，与其他腹泻病毒混合感染频发，给养猪业带来了巨大挑战。目前，尚无治疗PED的特效药物，尽管已有疫苗研发，但尚未实现大规模应用。因此，做好日常PEDV的筛查工作至关重要。有效的快捷检测方法是防控PED的关键，RT-PCR、qRT-PCR等分子生物学方法是检测PEDV感染的首选。在实际工作中，应根据试验条件、检测需求等因素，选择合适的检测方法或综合运用多种检测方法，以实现对PEDV的精准检测，有效防控疾病暴发。

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