仔猪大肠发酵失衡（碳水化合物发酵不足、蛋白质发酵过度）是导致肠道功能紊乱、生长性能下降的核心诱因，而发酵豆粕（FSBM）作为优质生物饲料，其含有的益生菌、活性肽及功能性寡糖等成分，为调控肠道发酵提供了有效途径。本文基于体外肠道模拟发酵模型，系统探究湿发酵豆粕与干发酵豆粕对仔猪大肠发酵参数、菌群结构及代谢产物的干预效应。研究结果表明：发酵豆粕可显著富集仔猪大肠中丁酸产生菌，提高丁酰辅酶A转移酶基因表达量，使丁酸浓度最高提升18.39%；同时抑制产脲酶菌群增殖，降低脲酶基因数量及氨气产量，湿发酵豆粕组氨气减排达29.68%；代谢层面可促进碳水化合物代谢通路激活，增加4-氨基丁酸、乳酸等有益代谢物积累，减少蛋白质发酵衍生的戊酸、异戊酸等有害产物。体外肠道模型验证显示，发酵豆粕通过“菌群结构重塑-功能基因调控-代谢产物优化”的协同路径，实现大肠发酵模式的良性转变，且湿发酵豆粕的干预效果优于干发酵豆粕。本研究为发酵豆粕在仔猪无抗饲料中的应用提供了体外试验依据，也为精准调控仔猪肠道健康提供了技术参考。
发酵豆粕；仔猪；体外肠道模型；大肠发酵；肠道菌群；代谢产物
在规模化仔猪养殖中，断奶期肠道功能障碍是制约生产效益的关键瓶颈，而大肠发酵过程的平衡状态直接决定肠道微生态稳定性与营养利用效率。仔猪大肠作为微生物发酵的核心场所，其碳水化合物发酵产生的短链脂肪酸（尤其是丁酸）是肠道上皮细胞的主要能量来源，可促进肠道屏障修复；而蛋白质过度发酵产生的氨气、戊酸、异戊酸等产物则会损伤肠黏膜，诱发炎症反应与腹泻症状。传统豆粕因含有抗营养因子，且蛋白质消化吸收率低，易加剧大肠蛋白质发酵负担，而发酵处理可通过微生物代谢降解抗营养因子，生成益生菌、寡糖、活性肽等功能性成分，为改善肠道发酵环境提供了可能。
近年来，发酵豆粕在仔猪饲料中的应用研究多聚焦于体内饲养试验，证实其可提高平均日增重、降低料重比，并改善肠道菌群结构。但体内环境受宿主生理状态、饲养管理等多重因素干扰，难以精准解析发酵豆粕与肠道菌群及发酵代谢之间的直接关联。体外肠道模型凭借环境可控性强、试验周期短、可排除宿主干扰等优势，已成为研究肠道微生态互作机制的核心技术手段，能够直观反映底物与菌群的发酵代谢关系。
当前关于发酵豆粕干预仔猪大肠发酵的体外研究仍存在诸多亟待明确的问题：不同加工工艺（湿发酵vs干发酵）对发酵效果的影响差异、菌群结构重塑的关键靶点、代谢通路调控的核心机制等尚未完全阐明。基于此，本研究通过构建体外肠道模拟发酵体系，以仔猪大肠内容物为菌源，系统分析发酵豆粕对大肠发酵参数（挥发性脂肪酸、氨气产量）、菌群结构多样性、功能基因表达及代谢产物谱的影响，揭示发酵豆粕干预仔猪大肠发酵的分子机制与菌群调控路径，为发酵豆粕的优化应用及仔猪肠道健康调控提供理论支撑与技术参考。
二、材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 发酵豆粕制备
选用枯草芽孢杆菌KC101（1.0×10¹⁰ cfu/g）、酿酒酵母JM102（1.0×10⁹ cfu/g）及乳杆菌RG103（2.5×10⁹ cfu/g）为复合发酵菌种。基础发酵体系配置：将50g葡萄糖、4g枯草芽孢杆菌、2g酿酒酵母、2g乳杆菌与516mL超纯水混合，静置活化4h后，与1426g豆粕充分拌匀，密封于3L烧杯中。采用35℃恒温厌氧发酵4d，获得湿发酵豆粕（含水率约35%）；将湿发酵豆粕置于60℃烘干至含水率10%，即为干发酵豆粕。发酵过程中监测微生物数量及功能性成分变化，确保发酵终点（4d）时益生菌数量与甘露寡糖、β-葡聚糖含量趋于稳定。
2.1.2 菌源制备
选取41日龄健康三元杂交（杜×长×大）仔猪75头，初始体重13.14±0.22kg，随机分为对照组、湿发酵豆粕组、干发酵豆粕组，每组5个重复，每个重复5头猪。对照组饲喂基础日粮，湿发酵豆粕组添加7.33%湿发酵豆粕（折合5%干物质），干发酵豆粕组添加5.00%干发酵豆粕，试验期28d。饲养结束后，每组随机选取3头仔猪屠宰，快速分离大肠各段（盲肠、结肠、直肠）内容物，混匀后称取20g，按1:3比例加入预热至39℃的缓冲溶液，四层纱布过滤后持续通入CO₂维持厌氧环境，制成体外发酵菌源混悬液。
2.1.3 试剂与仪器
主要试剂包括偏磷酸、巴豆酸、刃天青、还原剂（含硫化钠、半胱氨酸盐酸盐）、常量元素溶液、微量元素溶液等；仪器设备涵盖39℃恒温空气摇床培养箱、高效液相色谱仪（HPLC）、实时荧光定量PCR仪（qPCR）、次氯酸钠-水杨酸分光光度检测装置、高速冷冻离心机等。
2.2 体外肠道模型构建与发酵培养
参照Menke等改良的体外产气法构建发酵体系：① 制备接种液：将474mL超纯水、237mL常量元素溶液、237mL缓冲溶液预热至39℃，加入0.12mL微量元素溶液、1.22mL刃天青溶液，通CO₂ 10min除氧后，加入50mL还原剂溶液，持续通CO₂至溶液无色，制成1000mL厌氧接种液；② 发酵体系配置：在100mL玻璃发酵罐中加入500mg对应组日粮（底物），注入30mL混合发酵液（菌源混悬液与接种液按1:2比例混合），排尽罐内空气后密封；③ 培养条件：置于39℃恒温摇床中，以60rpm转速厌氧培养24h，记录总产气量变化。每个处理设置6个重复，对照组以基础日粮为底物，试验组分别以含湿发酵豆粕、干发酵豆粕的日粮为底物。
2.3 测定指标与方法
2.3.1 发酵参数测定
• 挥发性脂肪酸（VFA）：取24h发酵液1mL，加入0.2mL 25%偏磷酸与0.2mL 42mmol/L巴豆酸，4℃、10000rpm离心10min，上清液过0.22μm滤头后，采用HPLC测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸含量及总VFA浓度。
• 氨气产量：采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法，通过硫酸吸收液捕获发酵罐内氨气，测定吸光度值并计算产量。
• 脲酶活性：采用靛酚蓝比色法测定发酵液中脲酶活性，反映蛋白质发酵强度。
2.3.2 菌群结构与功能基因分析
• 菌群多样性：提取发酵液微生物总DNA，采用Illumina MiSeq技术对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行测序，分析OTU聚类、Alpha多样性（Shannon指数、Simpson指数）及菌群组成结构。
• 功能基因定量：采用qPCR技术测定丁酰辅酶A转移酶（丁酸合成关键基因）与脲酶基因（产氨关键基因）的相对表达量，以16S rRNA为内参基因，采用2Ct法计算基因相对丰度。
2.3.3 代谢组学分析
采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术测定发酵液代谢产物，通过PCA、PLS-DA模型筛选差异代谢物，结合KEGG数据库进行代谢通路富集分析，重点关注碳水化合物代谢与蛋白质代谢相关产物变化。
2.4 数据统计分析
采用Microsoft Excel 16整理原始数据，通过SPSS 28.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用Tukey检验，P<0.05表示差异显著，结果以“平均值±标准误（M±SE）”表示。
三、结果与分析
3.1 发酵豆粕对仔猪大肠体外发酵参数的影响
3.1.1 挥发性脂肪酸（VFA）组成与浓度
三组发酵液中乙酸、丙酸、异丁酸及总VFA浓度无显著差异（P>0.05），但丁酸、戊酸浓度存在显著组间差异（表1）。与对照组相比，湿发酵豆粕组丁酸浓度显著提高18.39%（P<0.05），干发酵豆粕组提高15.15%（P>0.05）；湿发酵豆粕组戊酸浓度显著降低15.63%（P<0.05），干发酵豆粕组降低8.33%（P<0.05）；异戊酸浓度呈现相似变化趋势，湿发酵豆粕组与干发酵豆粕组分别较对照组降低32.24%和18.25%（P<0.05）。结果表明发酵豆粕可特异性促进丁酸合成，抑制支链脂肪酸生成，且湿发酵豆粕的调控效果更显著。
表1 发酵豆粕对仔猪大肠体外发酵VFA浓度的影响（mmol/L，M±SE）
指标 对照组 干发酵豆粕组 湿发酵豆粕组
乙酸 32.65±1.24 33.18±1.09 34.22±1.15
丙酸 15.32±0.87 16.05±0.76 16.83±0.92
丁酸 8.26±0.41 9.51±0.38 9.80±0.45*
异丁酸 1.25±0.11 1.18±0.09 1.12±0.10
戊酸 5.00±0.23 4.58±0.18* 4.22±0.21*
异戊酸 2.98±0.15 2.44±0.12* 2.02±0.14*
总VFA 59.46±2.31 62.54±2.15 64.19±2.28
注：*表示与对照组相比差异显著（P<0.05）
3.1.2 氨气产量与脲酶活性
发酵豆粕组氨气产量与脲酶活性均显著低于对照组（P<0.05）。湿发酵豆粕组氨气产量较对照组降低29.68%，干发酵豆粕组降低17.73%，且湿发酵豆粕组显著低于干发酵豆粕组（P<0.05）；脲酶活性表现为对照组（0.82±0.06 U/mL）>干发酵豆粕组（0.65±0.05 U/mL）>湿发酵豆粕组（0.58±0.04 U/mL），湿发酵豆粕组与对照组差异显著（P<0.05）。总产气量方面，湿发酵豆粕组（28.65±1.32 mL）显著低于干发酵豆粕组（32.18±1.25 mL）与对照组（35.42±1.46 mL）（P<0.05），表明发酵豆粕可通过抑制蛋白质发酵减少气体产生。
3.2 发酵豆粕对仔猪大肠菌群结构与功能基因的影响
3.2.1 菌群多样性变化
Alpha多样性分析显示，发酵豆粕组Shannon指数显著高于对照组（P<0.05），Simpson指数显著低于对照组（P<0.05），其中湿发酵豆粕组Shannon指数（3.86±0.15）最高，表明发酵豆粕可提高仔猪大肠菌群物种多样性与均匀度（表2）。OTU聚类分析显示，三组共有的OTU数量为326个，湿发酵豆粕组特有OTU数量（48个）多于干发酵豆粕组（35个）与对照组（22个），提示发酵豆粕可引入或富集特异性功能菌群。
表2 发酵豆粕对仔猪大肠菌群Alpha多样性的影响（M±SE）
指标 对照组 干发酵豆粕组 湿发酵豆粕组
Shannon指数 3.21±0.12 3.58±0.14* 3.86±0.15*
Simpson指数 0.28±0.03 0.21±0.02* 0.17±0.02*
丰富度指数（ACE） 428.35±18.62 465.78±21.35 492.41±23.18*
注：*表示与对照组相比差异显著（P<0.05）
3.2.2 菌群组成结构
门水平上，对照组以厚壁菌门（62.35%）、拟杆菌门（28.65%）为主，发酵豆粕组拟杆菌门相对丰度显著提高（湿发酵豆粕组35.82%、干发酵豆粕组31.46%），厚壁菌门相对丰度略有下降，但厚壁菌门/拟杆菌门比值无显著变化（P>0.05）。科属水平上，发酵豆粕组显著富集丁酸产生菌，其中乳杆菌属、普雷沃氏菌属2、毛螺菌科UCG-004、瘤胃菌科UCG-005相对丰度显著高于对照组（P<0.05）；同时显著降低链球菌属、柠檬酸杆菌属等氨基酸发酵细菌的相对丰度（P<0.05），湿发酵豆粕组上述菌群变化幅度更为明显。
3.2.3 功能基因表达
qPCR结果显示，发酵豆粕组丁酰辅酶A转移酶基因相对表达量显著高于对照组（P<0.05），湿发酵豆粕组（2.86±0.21）是对照组（1.00±0.08）的2.86倍，干发酵豆粕组（2.15±0.17）是对照组的2.15倍；脲酶基因相对表达量则呈现相反趋势，湿发酵豆粕组（0.42±0.05）与干发酵豆粕组（0.61±0.07）显著低于对照组（1.00±0.09）（P<0.05）。功能预测分析显示，发酵豆粕组碳水化合物代谢功能基因家族相对丰度显著提高，氨基酸代谢功能基因家族相对丰度显著降低（P<0.05）。
3.3 发酵豆粕对仔猪大肠代谢产物谱的影响
代谢组学分析共鉴定出135个差异代谢物，其中与碳水化合物代谢相关的4-氨基丁酸、乳酸、甘露醇、苏糖醇等产物在发酵豆粕组显著积累（P<0.05），与蛋白质代谢相关的1,3-二氨基丙烷、肌酸、甘氨酸、肌苷等产物显著减少（P<0.05）。通路富集分析显示，干发酵豆粕主要通过激活4-氨基丁酸途径调控碳氮代谢，而湿发酵豆粕可同时激活4-氨基丁酸途径、β-丙氨酸途径和5-氨基戊酸途径，实现碳水化合物发酵的全面强化与蛋白质发酵的深度抑制。
四、讨论
4.1 发酵豆粕对仔猪大肠发酵模式的调控效应
仔猪大肠发酵的核心平衡在于碳水化合物发酵与蛋白质发酵的比例协调，丁酸作为碳水化合物发酵的关键产物，其浓度升高可促进肠道上皮细胞增殖、增强肠道屏障功能，而蛋白质发酵产生的氨气、戊酸等则具有肠黏膜毒性。本研究体外模型结果显示，发酵豆粕可显著提高丁酸浓度（最高18.39%）、降低氨气产量（最高29.68%），这与体内试验中发酵豆粕提高仔猪大肠丁酸浓度、降低蛋白质发酵产物的结论一致，证实发酵豆粕可通过重塑发酵模式实现大肠微生态的良性转变。
不同加工工艺对发酵豆粕的干预效果存在显著影响，湿发酵豆粕因保留了更多活性益生菌与未被破坏的功能性寡糖，其促进丁酸合成、抑制氨气产生的效果优于干发酵豆粕，这与吴先华等研究中湿发酵豆粕提高仔猪平均日增重和粗蛋白消化率的幅度大于干发酵豆粕的结果相符。推测烘干过程可能导致部分益生菌失活及热敏性功能性成分降解，降低了发酵豆粕对肠道发酵的调控效率。
4.2 发酵豆粕调控仔猪大肠菌群结构的核心机制
肠道菌群是发酵代谢的执行主体，其结构组成直接决定发酵产物类型与比例。本研究发现发酵豆粕可提高仔猪大肠菌群多样性，这与熊云霞等研究中复合益生菌发酵豆粕增加断奶仔猪肠道菌群丰富度的结果一致，而菌群多样性的提升有助于增强肠道微生态系统的稳定性与抗干扰能力。
从菌群组成来看，发酵豆粕显著富集乳杆菌属、普雷沃氏菌属2等丁酸产生菌，这类菌群可通过分解碳水化合物生成丁酸，同时抑制有害菌增殖；而链球菌属等氨基酸发酵细菌的减少，直接降低了蛋白质发酵强度，减少有害产物生成。功能基因层面，丁酰辅酶A转移酶基因的上调与脲酶基因的下调，从分子水平证实了发酵豆粕对丁酸合成通路的激活与产氨通路的抑制，这一调控机制在体内外试验中均得到验证，表明菌群功能基因的表达变化是发酵模式转变的核心驱动因素。
发酵豆粕中含有的益生菌（枯草芽孢杆菌、乳杆菌等）、功能性寡糖（甘露寡糖、β-葡聚糖）及活性肽是调控菌群结构的关键物质基础：益生菌可直接定植于肠道并发挥作用，寡糖作为益生元可选择性促进有益菌增殖，活性肽则可抑制有害菌生长，三者协同作用实现菌群结构的优化重塑。
4.3 发酵豆粕干预大肠代谢的通路协同机制
代谢组学分析揭示了发酵豆粕调控碳氮代谢的具体通路，干发酵豆粕主要通过4-氨基丁酸途径调控代谢平衡，而湿发酵豆粕可激活多条代谢通路，这一差异可能源于湿发酵豆粕更丰富的功能性成分组合。4-氨基丁酸作为重要的抑制性神经递质，其积累可缓解肠道应激反应，同时参与能量代谢过程；β-丙氨酸途径的激活则进一步强化了碳水化合物的高效利用，减少了蛋白质作为能量来源的分解消耗。
发酵豆粕组碳水化合物代谢产物的积累与蛋白质代谢产物的减少，本质上是菌群结构重塑后的功能体现：碳水化合物代谢功能基因的富集与有益菌的增殖，提升了底物中碳水化合物的降解效率，而氨基酸代谢基因的减少则直接抑制了蛋白质的过度分解。这种代谢通路的协同调控，不仅优化了肠道营养利用模式，还减少了有害代谢产物的积累，为仔猪肠道健康提供了双重保障。
4.4 体外肠道模型的优势与研究局限性
体外肠道模型排除了宿主生理状态、饲养环境等干扰因素，能够精准量化发酵豆粕与肠道菌群、代谢产物之间的因果关系，试验周期短且重复性高，为机制研究提供了高效平台。本研究通过体外模型验证了发酵豆粕对大肠发酵的调控效应，与体内试验结果的一致性表明，该模型可有效模拟仔猪大肠发酵环境，其研究结果具有较高的参考价值。
但体外模型仍存在一定局限性：无法模拟肠道蠕动、消化液分泌等体内生理过程，且发酵时间（24h）较短，难以反映长期发酵的动态变化。未来研究可结合动态体外发酵模型，延长发酵周期，并引入肠道上皮细胞共培养体系，进一步提升研究的真实性与全面性。
五、结论
本研究基于体外肠道模型的系统分析表明，发酵豆粕可通过“菌群-基因-代谢”的三级调控路径干预仔猪大肠发酵：首先通过富集乳杆菌属、普雷沃氏菌属2等有益菌，提高肠道菌群多样性；其次上调丁酰辅酶A转移酶基因表达、下调脲酶基因表达，激活碳水化合物代谢通路、抑制氨基酸代谢通路；最终实现丁酸等有益发酵产物的积累与氨气、戊酸等有害产物的减少，构建良性发酵模式。湿发酵豆粕因保留了更多活性成分，其干预效果显著优于干发酵豆粕。
本研究为发酵豆粕调控仔猪肠道健康的作用机制提供了体外试验佐证，明确了其优化大肠发酵的核心靶点与通路。在生产实践中，建议优先选用湿发酵豆粕（或优化干发酵工艺以保留活性成分），通过精准添加实现仔猪大肠发酵的定向调控，为仔猪无抗养殖提供技术支撑。未来可进一步开展发酵豆粕与其他功能性饲料添加剂的协同作用研究，结合体内外试验构建更完善的肠道健康调控体系。
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