牛病毒性腹泻病的诊断及防控策略

牛病毒性腹泻（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus，BVDV）感染引起的一种接触性传染病，是严重危害全世界养牛业的重要疫病之一。牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科（Fla-vivirus）瘟病毒属（Pestivirus），可感染包括牛在内的多种家畜。牛对BVDV易感，是BVDV的自然宿主，以乳牛和黄牛为主，其次是水牛和耗牛，尤其易感6~18月龄的犊牛，而且BVDV也能感染羊、猪等家畜及骆驼、鹿、羊驼等一些野生的反刍动物。BVDV致病率高、变异性大、分布范围广、宿主动物多，但死亡率低，该病主要造成宿主腹泻、流产、胎儿畸形并损伤呼吸系统，还可造成持续性感染和免疫抑制，从而降低动物机体的免疫力，也极易诱发其他致病原的继发感染或混合感染，严重影响牛群的生产情况和健康状态，导致持续性的经济损失BVD一般呈地方性流行且该病一年四季均可发生，以初春、夏末以及秋初气候多变季节居多。目前，全球共88个国家报道了BVDV，除南极洲外，其他六大洲都有报道。BVDV给动物机体带来的危害不仅包括动物死亡和生产性能下降导致的直接经济损失，还包括控制疫病所产生的间接开支，是全球最重要的牛传染病之一，因此世界动物卫生组织（OIE）将其认定为B类传染病，我国将其定为二类传染病，需积极防控。BVDV在世界范围内仍未得到有效控制，准确的诊断方法和有效的防控策略对该病的防治意义重大，因此，本文对近年来应用较为广泛的诊断方法和防控策略进行了总结，可为该病的诊断和防控提供参考。

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，基因组由长度约12.3kb的正链RNA分子组成，与DNA病毒相比，RNA病毒具有高度的可变性，可分为BVDV-1、BVDV-2和HoBi样病毒（通常称为BVDV-3或牛非典型瘟病毒）3个种，并根据基因组的系统发育分析分为多个亚型，同时根据BVDV接种细胞是否产生病变，还可分为无细胞病变（NCP）株和细胞病变（CP）株。

BVDV于1946年首次在美国纽约被发现，报道其为传染性疾病，继而在全球数十个国家相继报道。我国20世纪80年代从国外引进牛的流产胎儿中首次分离到BVDV，目前BVDV在我国多个地区具有较高的感染率，至少有9种亚型流行，包括BVDV-1a、-1b（1b1和1b2）、-1c、-1d、-1m、-1o、-1p、-1q和BVDV-2a，其中BVDV-1b亚型是我国多个地区主要流行的亚型。该病毒具有多种传播方式，既可以通过接触传播，也可以在母牛和小牛之间垂直传播，主要依靠接触传播。相较于成年牛，犊牛较为易感，是主要发病群体染和持续性感染，据估计，急性感染的年发病率为34.0%。当前研究表明，不仅在牛群中可以检测到各亚型的BVDV病原，而且在猪和各种反刍动物的宿主中也可以检测到BVDV，包括绵羊、山羊、牦牛、水牛、美洲驼、羊驼、骆驼和鹿。在模拟低毒BVDV毒株造成的损失时，估计每年的总损失为每百万头犊牛2000万美元；在感染发生率相同的情况下，高毒力BVDV毒株造成的损失估计为每百万头犊牛5700万美元。

近些年，我国养牛业发展迅速，同时BVDV发生也遍及全国各个省区，目前，新疆、陕西、青海、宁夏、甘肃、内蒙、黑龙江、河南、山东、江苏、安徽、四川、广西等20多个省、自治区相继报道有本病的发生，宿主包括奶牛、肉牛、水牛、耗牛以及猪，其中奶牛的感染情况最为严重BVDV抗体阳性率为85%以上，持续感染（PI）牛平均阳性率为0.4%；福建省规模化养殖场BVDV血清平均阳性率为92.5%，最高可以达到100%，散养户BVDV血清阳性率为12.3%。牦牛的综合感染率为36.0%，其中新疆牦牛BVDV阳性率最高，可以达到67.5%。中国安徽、河南、内蒙古、甘肃、新疆五省（自治区）牛的患病率经证实差异很大（24.4%<67.5%），超过46.7%的牛场BVDV抗原检测为阳性，牛群中BVDV持续性感染率为2.2%，感染严重程度远远高于亚洲多数国家，同时也比欧美国家牛的感染率要高。BVDV的广泛流行是制约我国养牛业生产水平的重要原因之一，因此需要采取相应措施加以控制。

2.1临床诊断

BVDV的潜伏期一般为7~14d，根据病情发展程度、发病年龄以及发病次数的不同，将牛病毒性腹泻（BVD）分为急性型和慢性型。急性BVD多发生在首次接触该病毒的牛群中，重度急性症状可引起肺炎、急性高热（体温可升高至40℃）甚至猝死，具有较高的死亡率，在某些情况下还会出现出血综合征。急性BVD可引起显著的组织病变，主要为沿消化道的多个组织的溃疡或糜烂。而70%～90%的血清阴性、非妊娠病例表现为亚临床感染或轻度临床疾病，出现轻度发热、厌食和产奶量下降。对于BVDV感染后的公牛，部分还会出现睾丸发育不正常。犊牛和妊娠母牛多呈现重度急性症状，主要造成妊娠母牛流产、胎儿吸收、先天畸形、木乃伊胎儿以及犊牛先天性感染。慢性BVD多发于老疫区或年龄较大的牛群，BVD若得到及时治疗症状可逐渐减轻，但会持续散播病毒。

病死牛剖检可见口腔黏膜糜烂或溃疡；食道黏膜出现纵行排列的糜烂斑，胃肠黏膜呈现不同程度的充血、出血、溃疡，小肠黏膜绒毛萎缩；淋巴结肿大，切面多汁，有时可见出血；脾脏边缘有梗死灶。组织病理学观察可见口腔、食道和胃肠黏膜上皮细胞变性、坏死，固有层有大量淋巴细胞、浆细胞浸润；小肠绒毛缩短、融合，上皮细胞脱落，隐窝细胞增生；淋巴组织中淋巴细胞减少、坏死，网状细胞增生；肾脏可见肾小管上皮细胞变性、坏死，间质有炎性细胞浸润；肝脏细胞轻度变性，汇管区有少量炎性细胞。这些病理变化是诊断牛病毒性腹泻的重要依据，也有助于了解疾病的发生发展机制，为该病的防控提供理论基础。

2.2实验室诊断

通过临床症状和病理变化在许多情况下只能做初步诊断，只有结合实验室诊断才可以更加精确地鉴定病原种类。病原检测一般包括3个方面，即病原分离、抗原检测和核酸检测。部分诊断方法虽然可行，但往往由于设备和技术要求较高、耗时较长、结果稳定性差等原因，难以在动物生产一线开展检测，如病毒分离培养、免疫荧光试验、血清中和试验、琼脂扩散试验、免疫组化等。目前最为常用的BVDV检测方法为酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），其中ELISA法方便、快速，可满足对大量样品进行检测的需要，不但能检测已经发病的动物，而且还可检测冻精、胎牛血清、疫苗、胚胎等，但ELISA检测方法存在同属病毒的交叉反应、初乳抗体的干扰、不能检测持续感染牛等缺点；RT-qPCR不受中和抗体的干扰，特异性和敏感性较高，但是需要一定的设备和技术条件。随着BVDV诊断研究的进展，一些新兴的检测方法将为BVDV的诊断提供更多选择。

2.2.1环介导等温扩增环介导等温扩增（LAMP）检测技术是一种在恒温条件下利用链置换DNA聚合酶实现核酸快速扩增的方法，该法利用Bst DNA聚合酶的链置换特性，依据靶基因的6个特定区域设计引物，在一定的温度下识别靶基因的多个位点并能连续对其进行替换。该方法对设备要求不高，仅需水浴锅或常规加热仪器就可快速检测目的基因，无需复杂精密的仪器，具有简单高效、灵敏度高、特异性强、经济适用等优点，在发展中国家基层测试试验中具有良好的应用前景。目前，LAMP检测技术在病原检测中得到了广泛应用，具有显著的优势。早在2012年，基于LAMP检测BVDV的RT-LAMP方法已被开发出，该方法灵敏度和特异性与RT-qPCR相当，比RT-PCR灵敏度高1000多倍。近期，郑如雯等将LAMP与横向流动层析试纸（LFD）相结合，开发了LAMP-LFD检测BVDV的方法，该法不仅具有LAMP的高灵敏度和高特异性，更简化了操作，且结果呈现更为清晰，可以在内得到结果，具有较好的临床应用前景。

2.2.2 CRISPR-Cas系统检测CRISPR技术（CRISPR-Cas）可以精准靶向核酸序列，起初多用于基因编辑，但同时也对病原检测带来了变革性影响，基于CRISPR-Cas开发的核酸检测平台具有较高的灵敏度和特异性。来自V类的CRISPR-Cas13系统与其他CRISPR系统的区别在于其可识别和切割ssRNA分子，因此这种特性已被用于开发一种迅速且具特异性的病毒检测技术。近年来基于CRISPR-Cas13a系统检测BVDV的诊断技术取得突破性进展，其在核酸水平上检测病原具有较高的特异性和灵敏度，只需获取疑似动物的RNA样本加入到反应体系中进行荧光检测即可，最快可在1h内获得结果。该检测平台所用到的试剂可以冷冻干燥，便于长期储存，有望为现场检测BVDV提供更便捷的途径。

2.2.3重组酶聚合酶扩增重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是一种新的等温扩增技术，模拟DNA的复制机制，依赖重组酶、单链结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶进行扩增。该技术不限于扩增双链DNA，在使用逆转录酶的情况下可用于扩增RNA模板，通过特异性探针产生荧光信号，从而确定目的片段的存在，具有高特异性、高灵敏性、快速性等优点。2024年，基于该技术的一项新的针对BVDV和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的混合诊断方法被开发出来，该方法结合RPA技术和LFD，可在35℃孵育25min后快速完成反应，不用借助荧光装置即可辨别是否阳性，且临床样品检验结果与RT-qPCR结果一致，该方法适用于牛场中快速、准确和方便的BVDV检测。