猪蓝耳病的免疫抑制及其疫苗的再认识

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种重要猪传染病。PRRSV是一种单股正链RNA病毒，具有高变异频率和强传播能力，能够在猪体内持续感染并导致免疫系统紊乱。尽管几十年来采取了多种防控措施，并研发了十余种商品化疫苗，该病仍未得到有效控制，依然是长期影响全球养猪业健康发展的重要疫病之一。

猪蓝耳病自20世纪80年代首次出现以来，全球养猪业历经近40年仍未找到有效的控制方法。该疾病的长期流行与病毒本身的特性密切相关：其传染性强、变异率高且能够持续感染宿主，赋予了它顽强的生存能力。此外，现有疫苗的安全性和免疫效力存在局限性，加之使用不当，进一步加剧了防控难度。

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PRRSV感染导致猪的免疫紊乱

PRRSV的体内感染过程通常可以分为三个不同的阶段：急性感染期、持续感染期和病毒清除期。在急性感染期，肺部是主要的感染部位，PRRSV主要在肺部和上呼吸道的巨噬细胞中进行复制。感染后12h左右，宿主会出现短暂的病毒血症，这一状态可能会持续数周。进入持续感染期后，血液和肺部不再检测到病毒，猪只表现为无明显临床症状。此阶段，病毒主要在免疫器官如扁桃体和淋巴结等处进行复制。这些局部淋巴结中持续复制的病毒可通过口腔、鼻腔分泌物及精液有效传播给未感染的猪只。在第三阶段即病毒清除期，病毒复制逐渐减少，最终在宿主体内完全消失。淋巴器官是病毒清除前最后的残存部位，研究显示PRRSV的彻底清除可能需要至少150 d。

1.1 PRRSV感染干扰猪特异性免疫

PRRSV通常在感染后第5～7天激活机体产生抗体。在感染初期，机体首先产生针对PRRSVN蛋白的抗体，但这些抗体并不参与免疫保护。此外，在病毒感染早期阶段，还可以检测到针对非结构蛋白（如nsp2）的抗体。血清中和抗体（NAbs）一般在感染28d后才出现。研究表明，多种因素可能导致NAbs的延迟出现，包括GP5蛋白N端糖基化的屏蔽效应、中和表位上游存在免疫诱饵表位、抗体依赖性增强效应、PRRSV抑制先天免疫反应的能力以及PRRSV对B细胞正常发育的影响。血清转移试验表明，高滴度的NAbs可以为仔猪提供被动保护。尽管NAbs具有保护作用，但在接种疫苗后的仔猪即使未检测到NAbs，仍能对强毒力毒株提供保护，这表明疫苗诱导的细胞免疫在免疫保护中发挥重要作用。受感染的猪通常在第4周开始出现T细胞介导的免疫反应，并可持续长达3个月。T细胞特异性γ-干扰素（γ-IFN）的产生被视为衡量细胞免疫水平的重要指标，其反应延迟与中和抗体相似。

树突状细胞（DCs）作为高效的抗原递呈细胞（APCs），在诱导T细胞反应和维持免疫应答方面发挥着至关重要的作用。PRRSV感染显著干扰了DCs的抗原递呈功能，具体表现为：感染导致单核细胞源性树突状细胞（Mo-DCs）和骨髓源性树突状细胞（BM-DCs）中MHCI类和II类分子表达下调，并通过诱导细胞凋亡机制加速DCs的死亡。这些变化共同导致了特异性免疫反应的延迟。

此外，在PRRSV感染后，CD4+和CD8+T细胞的响应水平较低，表明细胞介导的免疫反应不仅暂时性减弱，而且出现延迟。PRRSV感染还能够引起不同程度的胸腺萎缩及胸腺细胞凋亡。值得注意的是，PRRSV感染可在体内和体外激活调节性T细胞（Tregs），某些毒株甚至能诱导Tregs并上调转化生长因子β（TGF-β）的表达，这有助于病毒在宿主体内的持续感染，并增加继发感染的风险。此外，PRRSV感染还会引发相关淋巴组织病变，在淋巴器官中可观察到明显的细胞凋亡现象。

1.2 PRRSV感染干扰天然免疫

病毒感染可通过特定的病原相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRRs），从而启动机体抗病毒信号传导级联反应，促进干扰素（IFN）和趋化因子等细胞因子的生成。这些先天免疫反应对于控制早期病毒感染及启动适应性免疫系统至关重要。RNA病毒感染后，病毒RNA通过RIG-I样受体（RLRs）或Toll样受体（TLRs）被识别，触发一系列信号传递，激活转录因子IRF-3/7和NF-κB，进而上调IFN-α/β的表达。IFN-α/β与受体IFNAR1和IFNAR2结合后，激活JAK-STAT信号通路，诱导干扰素刺激基因（ISG）表达，维持细胞内抗病毒状态。PRRSV能够抑制干扰素产生，以逃避宿主免疫反应。研究表明，在猪感染PRRSV后，其肺部分泌物中几乎检测不到IFN-α的产生；即使在猪先感染传染性胃肠炎病毒（TGEV）后再感染PRRSV，PRRSV仍能有效阻止IFN-α的产生。目前已有研究表明，多种PRRSV病毒蛋白能够作为IFN拮抗剂。如，nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp2TF、nsp2N、nsp4、nsp7、nsp11和N蛋白。

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PRRSV疫苗的安全性与有效性

疫苗接种是预防和控制传染病最为有效且实用的手段之一。当前，用于预防PRRSV感染的商业疫苗主要包括灭活疫苗和减毒活疫苗（MLV）。这些疫苗能够显著降低猪只的临床症状及病毒血症水平，但其保护效果主要局限于同源毒株，对于异源毒株的效果有限。因此，亟待开发能够诱导更强免疫反应并提供更广泛交叉保护的新一代疫苗。

2.1 PRRS弱毒疫苗

自PRRSV疫情暴发以来，市场上已推出多种商业化的MLVs。然而，这些疫苗通常仅能引发相对较弱的体液免疫和细胞介导免疫反应。尽管PRRSVMLVs对同源野生型PRRSV毒株提供了有效的免疫保护，但对异源毒株的保护效果有限或几乎无效。除了免疫保护效果外，PRRSVMLVs的安全性问题也引起了广泛关注。研究表明，接种PRRSVMLVs后的猪只可能在长达四周的时间内出现病毒血症，从而可能导致疫苗株传播给未感染PRRSV的仔猪。此外，PRRSVMLVs存在恢复毒力的风险。

2.2 PRRS灭活病毒疫苗

与MLV不同，灭活的PRRSV疫苗以其卓越的安全性著称。然而，多项研究表明，PRRSV灭活疫苗仅能诱导较低水平的特异性中和抗体，并且缺乏有效的细胞介导免疫反应。因此，该疫苗诱导的中和抗体滴度通常不足以有效清除病毒。值得注意的是，有研究指出，通过纳米颗粒封装并结合新型佐剂的灭活PRRSV疫苗能够提供对异源PRRSV毒株的广泛交叉保护，这表明特定的疫苗形式和佐剂组合可以显著增强灭活PRRSV疫苗的免疫效果。此外，长期为血清阳性的母猪接种灭活疫苗可提高其PRRSV抗体水平，并显著改善其繁殖性能。总体而言，当前的PRRSV灭活疫苗在控制已感染猪群方面可能具有潜在的应用价值，但在预防方面的效果仍需进一步研究和改进。

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PRRSV新型疫苗研发

研究人员持续开发基因工程疫苗，如病毒载体、亚单位和DNA疫苗。这些新型疫苗具有设计简便、安全性高和免疫原性强的优点。目前，多种表达PRRSV结构蛋白的亚单位疫苗已被评估。例如，表达GP5和M蛋白的重组TGEV能部分保护仔猪免受PRRSV感染。使用减毒PRV作为载体表达GP5和M蛋白，可显著减少攻毒后仔猪的病毒血症和肺部病变。表达GP3、GP5和猪GM-CSF融合蛋白的重组腺病毒载体诱导更高水平的中和抗体，减轻临床症状和降低病毒载量。DNA疫苗编码PRRSVGP5基因，可诱导特异性中和抗体和细胞免疫反应，提供免疫保护，减少病毒血症和肺部病变。结合细胞因子作为佐剂也显示出良好效果。例如，将CTLA4与PRRSVGP5融合表达的DNA质粒免疫小鼠，显著提高体液和细胞免疫水平。共表达M和猪IL-18基因的DNA疫苗诱导更高水平的IFN-γ和IL-2，并增强特异性T淋巴细胞增殖反应。尽管PRRSV疫苗仍面临挑战，但基因工程疫苗展示了巨大潜力，需取得技术突破以实现实际应用。

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PRRSV疫苗研发的未来

反向遗传学是一种通过分析目标基因变化所引起的表型变化来研究基因功能的技术。在病毒学领域，该技术被广泛应用于探索病毒的复制、毒力、发病机制以及疫苗开发等方面。1998年，首个PRRSV感染性克隆建成。目前，利用反向遗传学技术对病毒基因组进行改造，以获得突变或重组的后代病毒，为开发减毒活疫苗提供了新的途径。

4.1 增强I型干扰素（IFN-I）的表达

PRRSV编码多种能够抑制先天性免疫反应的病毒蛋白。因此，通过删除或突变参与免疫调节的关键病毒基因，构建候选疫苗，是一种有效的策略。已有研究表明，对nsp1β中第16～20位氨基酸进行替换的突变病毒16-5A，相较于野生型毒株，显著增强了感染细胞中的IFN-I表达。此外，含有nsp4D185N突变的重组病毒表现出较慢的复制速度，并显示出更强的IFN-I诱导能力。而具有nsp11K59A突变的病毒几乎完全失去了抑制STAT2的能力。据报道，PRRSV-A2MC2毒株具有显著的IFN诱导能力，能够诱导针对同源和异源毒株的中和抗体，这表明增强IFN-I表达是开发有效PRRSV疫苗的重要策略之一。

4.2 基因嵌合和DNA重排

目前，疫苗的主要局限在于其交叉保护能力有限。为了扩大交叉保护范围，开发一种包含多种异源PRRSV毒株中多个中和表位的嵌合疫苗具有广阔前景。早期研究显示，通过将VR2332中的ORFs3-6替换为不同毒株的相应基因，并成功拯救出嵌合病毒，能够诱导产生具有交叉保护能力的中和抗体反应。此外，研究人员还探讨了野生型与减毒活疫苗（MLV）毒株之间的嵌合体，通过将MN184的ORF5-6替代IngelvacPRRSMLV相应基因后，接种可显著减轻仔猪攻毒后的临床症状。

DNA重排（DNA-shuffling）是一种体外重组技术，用于对单个基因或同源基因库进行重组，以扩展抗原的交叉反应性。例如，利用DNA重排技术，将VR2385或FosteraPRRSMLV毒株的GP3、GP4、GP5和M基因与完全不同的亲本病毒进行重组，构建嵌合病毒。研究表明，这些嵌合病毒显著增强了针对异源PRRSV毒株的交叉中和抗体活性。此外，分析了PRRSV-2的59株病毒的完整基因组序列，并选择“保守”序列生成共享基因组，从而拯救出嵌合病毒PRRSV-CON，该病毒比野生型PRRSV提供了更广泛的异源保护。

4.3 密码子对优化

大多数氨基酸由多个同义密码子编码，然而这些密码子在不同生物体中的使用频率并非随机分布，而是表现出特定的密码子使用偏好（CodonUsageBias，CUB）。CUB能够显著影响蛋白质合成效率。鉴于病毒复制依赖于宿主细胞机制，病毒基因组的密码子偏好通常与其宿主相适应。研究表明，密码子对去优化是制备减毒疫苗株的有效策略之一。例如，已成功构建了含有非偏好密码子对的减毒流感病毒和脊髓灰质炎病毒。研究人员利用特定计算机程序对GP5基因序列中的密码子对进行去优化，并成功拯救出相应的病毒。该病毒在体外的复制能力显著降低，接种猪只在攻毒后，病毒血症水平和肺部病变发生率均减少。此外，对nsp9中的同义密码子进行去优化后，拯救出的病毒在猪宿主体内的复制能力显著下降，且接种后未见明显临床症状。这种重组病毒能有效保护猪免受同源及异源PRRSV的攻击，所有接种重组病毒的猪在病毒攻毒后均存活，未出现明显临床症状或病理损伤。密码子对去优化作为疫苗开发策略，在安全性方面具有显著优势。通过引入大量核苷酸突变，即使发生恢复突变，也难以恢复成原始毒株。

4.4 细胞因子佐剂

细胞因子在诱导免疫反应中发挥着关键作用，因此常被用作疫苗的佐剂以增强其免疫原性。为了进一步强化免疫反应，可以将细胞因子的表达基因插入到减毒的PRRSV感染性克隆中，从而构建重组病毒。例如，成功拯救了表达猪IL-4或猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的重组PRRSV。免疫接种后，这些重组病毒在面对PRRSV攻毒时，显著增加了猪体内CD4+CD8+双阳性T细胞的比例；其中，表达GM-CSF的重组病毒还能够诱导更高水平的IFN-γ产生。此外，利用细胞因子作为增强细胞介导免疫反应的佐剂具有潜在价值，但仍需进一步探索更为有效的细胞因子组合及其应用策略。

4.5 开发新型的灭活PRRSV疫苗

在灭活的PRRSV疫苗中，选择适当的佐剂是提升疫苗效力的关键因素。目前已有多种策略被报道能够增强灭活PRRSV疫苗诱导的中和抗体滴度。例如，使用β-丙内酯（BPL）对PRRSV进行灭活处理后，将其与水/油乳液混合，并分两次免疫接种仔猪，可显著降低同源病毒攻击后的病毒血症水平。此外，采用紫外线辐射或二乙烯亚胺（BEI）对PRRSV进行灭活处理，并与不完全弗氏佐剂混合后肌肉注射，同样可以提高中和抗体滴度，并在同源病毒攻击后减少病毒血症。一个前景广阔的领域是基于纳米技术的疫苗递送系统。由于抗原呈递细胞（APCs）能够吞噬纳米颗粒（100～1000nm）中的抗原，并保护其免受蛋白酶降解，因此基于纳米颗粒的疫苗递送系统备受关注。一项研究显示，基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒的紫外灭活PRRSV（NanoPRRS）疫苗，通过单剂量鼻腔给药，在攻毒后未观察到临床症状，显著减少了肺部病变的发生，降低了病毒血症水平，并显著增加了中和抗体滴度和干扰素γ（IFN-γ）的产生。

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疫苗在猪蓝耳病防控中的作用再认识

鉴于PRRS弱毒疫苗和灭活疫苗分别在存在安全性和免疫效力存在的不足，单纯依赖PRRS疫苗想防控好PRRS是远远不够的。不恰当的疫苗使用甚至可能加速流行毒株的变异，从而增加疾病防控的复杂性和难度。以上原因使得许多猪场在选择疫苗时面临两难境地。此外，当前猪蓝耳病病毒的变异和重组能力逐渐增强，给新型疫苗的研发带来了更为严峻的考验。由于疫苗研发的速度难以跟上病毒变异的步伐，新推出的疫苗往往无法与当前流行的毒株完全匹配。经过全球几十年的实践证明，仅靠疫苗彻底控制PRRS是不现实的。因此，净化才是防控猪蓝耳病的根本解决方案。