一例由PEDV引起的猪腹泻病的鉴别诊断及免疫防控评估

1、试验材料与方法

1.1 疫苗、试剂、实验动物来源

试验所用弱毒疫苗为本实验室试制的猪流行性腹泻新毒株弱毒疫苗，商品灭活疫苗为猪传染性胃肠炎- 猪流行性腹泻二联灭活疫苗。总RNA 提取试剂盒购自Genemark 公司，猪流行性腹泻 IgA 和IgG 间接ELISA 检测试剂盒为本实验室研制，细胞培养相关试剂与材料购自gibco 和hyclone 公司。本研究实验动物来源于河北某规模化猪场。

1.2 临床观察及病理解剖

观察该场患病仔猪临床表现，包括精神、食欲状况及是否腹泻、消瘦。解剖腹泻严重仔猪，观察病理变化，并取材备用。

1.3 实验室病原学检测

采集患病仔猪小肠样品，研磨后反复

冻融3 次，采用TRIzol 法提取总RNA，使用同时可扩增PEDV M 基因、TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）N 基因、GAR（猪A 群轮状病毒）VP7 基因的多重RT-PCR 方法检测样品。

1.4 免疫评估内容

本试验主要对该场选用的母猪3 种不同免疫程序的防控效果进行评估。根据所使用疫苗种类我们将此3 组分为灭活疫苗组，联合疫苗组，弱毒疫苗组。

免疫防控的评估内容主要包括：安全性评价，即RT-PCR 病原学检测母猪粪样中PEDV 排毒情况，观察母猪及新生仔猪精神、食欲及腹泻情况等；免疫效力实验室评价，即通过ELISA检测抗PEDV IgA 抗体、IgG 抗体及通过中和试验检测中和抗体水平；临床生产成绩评价，即统计母猪产后7 d 窝均活仔数和存活率。

1.5 间接ELISA

采集该3 组母猪初乳共计42 份，于4 ℃，12 000 r/min 离心5 min， 弃去上层乳脂层，用灭菌枪头小心吸取中间层的乳清，分离后使用本实验室研制的试剂盒检测猪流行性腹泻病毒的IgA、IgG 抗体，检测方法依据试剂盒说明书。各抗体结果判定依据如下所述，以S/P 值作为衡量IgA 水平的标准，S/P值≥ 0.148 为阳性；S/P 值＜ 0.148为阴性。以OD 值作为衡量IgG水平的标准，OD 值≥ 0.433 为阳性；OD 值＜ 0.433 为阴性。

1.6 中和试验

将测好TCID50 的PEDV-YN144毒株病毒液稀释成200 TCID50/50μL的病毒悬液。在96 孔微量培养板中将上述处理的乳清作连续2 倍倍比稀释，在上述各孔内加入50 µL 稀释好的病毒液，混匀后放入37 ℃ 5% CO2 培养箱中作用60 min。同时设乳清对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照作200、20、2、0.2 TCID50 共4 个梯度对照。操作完成后弃去混合液并用DMEM 洗涤2 次，后每孔加入200 µL DMEM 维持液，于37 ℃ 5% CO2 培养箱培养，逐日观察并按Reed-Muench 两氏法计算结果，稀释液、洗涤液和维持液均为含10μg/mL胰酶的DMEM。

2、结果

2.1 临床观察及病理解剖结果

临床可见部分仔猪发病严重，主要表现为呕吐且多发于吃奶后，排黄白或灰色水样稀便（图1A），粪便恶臭。病猪表现为精神沉郁、食欲衰退，消瘦，脱水，患病仔猪常抱团（图1B）。新生仔猪多发，且死亡率高达50% 以上，一般腹泻3 ～ 4 d 后死亡，严重时常有整窝发病死亡情况。母猪未见腹泻症状。剖检主要病变为小肠膨胀，肠壁变薄（图1C），充满淡黄色液体或灰黄色液体（图1D），个别小肠黏膜有出血点，肠系膜淋巴结水肿。胃内容物少，或充满胆汁样的黄色液体。其他实质性器官无明显病变。

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