分子克隆

在现代生物科学研究中，分子克隆是构建重组DNA分子的关键技术之一。它不仅被广泛应用于基因功能研究，也是生产药物、疫苗和转基因作物的基础。然而，尽管分子克隆技术非常重要，但许多科研人员在实际操作过程中仍会遇到各种挑战。

1、定义：分子克隆指的是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达，又称基因克隆或DNA重组技术，通常包含两部分：目的DNA片段和可在宿主菌体内复制的载体。

2、关键流程：模板和质粒获取、目的基因与线性质粒纯化

3、提高克隆效率的简单技巧：

A、精心设计实验：注意连接处的序列，以及对翻译序列的阅读框的影响；在设计包含相似酶切位点序列的引物前，先检查载体和插入片段内部的酶切位点；确认载体的抗生素标记与所选宿主菌是否相容

B、使用高纯度争取浓度的DNA：确保DNA无污染，不含有核酸酶等酶活性;建议使用效果好的试剂盒来，以去除所有的溶剂，例如苯酚、氯仿和乙醇;使用无EDTA或盐离子的buffer洗脱DNA，以避免对酶切或PCR实验造成影响 。

C、谨慎进行酶切实验：反应体积大小应便于下游操作，如比电泳上样孔小一些，通常是20-50μl;体系中内切酶体积应不超过总体系的10%以确保甘油浓度低于5%，可有效降低星号活性 。

D、注意末端序列：通常待连接的 DNA末端是互补的，无需修饰即可直接连接;如果末端不互补，则需要用末端平齐化试剂，磷酸酶等进行修饰，如使用Taq酶扩增，3’端带A，高保真酶则产生平末端。非磷酸化PCR 产物在与去磷酸化的载体连接之前，需要激酶处理，在5’端加上一个磷酸基团。